Science单细胞谱系揭示了癌症异

1.追踪小鼠异种移植模型中的癌细胞转移

作者应用谱系追踪探索小鼠癌症模型中癌细胞转移扩散的亚克隆动力学，在小鼠原位异种移植模型中使用了人KRAS突变肺癌细胞系(A细胞)，因为该系统的特征是侵袭性转移，原位异种移植实验可用于模拟体内癌症进展，作者利用改良版的分子记录技术设计了A细胞（图1A）。作者设计了与靶位点核苷酸错配的sgRNAs，从而降低了它们的亲和力并调整了谱系记录速率，然后将大约个工程细胞(“A-LT”)包埋在基质凝胶中，并通过外科手术植入免疫缺陷小鼠(B-17SCID)的左肺(图1B)。作者通过荧光素酶的活体成像跟踪大块肿瘤的进展(图1C)。早期生物发光信号是适度的，局限于左肺，与植入位置一致；随时间推移，信号逐渐增加并扩散到整个胸腔，表明肿瘤生长和转移。54天后，将小鼠处死，并在5个肺叶、整个纵隔淋巴组织和肝脏上发现转移的肿瘤(图1D)，从这些肿瘤组织中，作者收集了六个样本，其中一个来自左肺(即包括原发部位；图1E，左侧)，分离肿瘤样品，采用荧光分选以排除正常小鼠细胞，最后进行单细胞RNA测序。为了同时测量细胞的转录状态和系统发育关系，作者分别制备了单独的RNA表达和靶点扩增子文库，从六个组织样品(图1E，右侧)中得到对单细胞谱。

图1.小鼠肺癌异种移植模型的单细胞谱系追踪

2.区分克隆癌细胞群体

影响谱系记录能力和发育树重建能力的特征在克隆群体之间不同，例如靶位点的拷贝数、含有独立indel修复序列的记录位点的百分比及其多样性。作者观察到，克隆群体在六个组织中呈现出不同的分布，范围从仅存在于主要部位(例如，CP，CP)，到在组织中过度表达(例如，CP，CP)，或广泛分布于所有取样组织(例如，CP，CP)。逻辑上讲，组织扩散的水平是癌细胞转移扩散的结果，因此可以告知过去转移事件的频率，为了量化组织分布和转移性播散之间的关系，作者定义了一个可观察的细胞组织分布与预期的细胞组织分布对比的统计指标，称为“组织分散评分”，作为一个粗略的、组织分辨的播散频率近似值。在该小鼠的个克隆群体中，作者观察到广泛的组织分散评分，表明肿瘤群体中广泛的转移异质性，接下来，作者使用进化的谱系信息，以更直接、更高的分辨率探索了这种异质性。

图2.高分辨率的系统发育树捕捉癌症种群的历史

3.单细胞分辨癌症系统发育

作者的谱系示踪剂的关键优势不在于遵循克隆谱系动力学，即来自细胞的静态整合子细胞，而在于重建亚克隆谱系动力学，即来自细胞连续进化的indel修复序列。因此，作者使用CRISPR技术重建了高分辨率系统进化树，并根据数据集的复杂性和规模定制了参数。每个家族树全面描述了克隆群体中所有细胞之间的系统发育关系，并总结了它们在组织间转移扩散的历史(图2)。这些家族树错综复杂，分辨率高。

为了说明该数据集中树的复杂性，作者提出了个细胞的代表性克隆群体(CP，图3A)，具有99.0%()的独特细胞谱系状态，平均广度为10，最大广度为20。直观地说，彼此关系更密切的细胞应该共享更多的谱系等位基因，这从分支内共享等位基因的模式和分支间区分等位基因的模式中显而易见(图3A，放大的嵌体)。事实上，作者发现在本例(图3B)和所有其他家族树中，系统发育距离(即树中两个细胞之间的距离)和等位基因距离(即两个细胞谱系等位基因之间的差异)之间存在系统一致性。可区分的Cas9诱导的indels的高度多样性(所有M5k细胞中有个独特的等位基因)也降低了同质性的可能性，这是一个使家族树重建复杂化并损害家族树准确性的问题。总之，这些特征表明，重建的家族树准确地模拟了细胞之间的真正系统发育关系。

图3.利用CRISPR技术绘制详细而准确的癌细胞谱系图

4.从系统发育推断和量化过去的转移事件

重构的系统发育显示出的一个显著特征，即密切相关的细胞在不同组织中存在的程度不同，这些模式直接源自祖先细胞过去从一个组织转移到另一个组织(即转移性种子)。不同的转移率在系统发育和组织之间产生不同的调和模式(图4A)。例如，非转移群体导致所有分支保留在单个组织内(图4，左侧A和B)；相反，高转移群体导致密切相关的细胞转移至不同的组织中(图4，右侧A和B)。最后，中等水平的转移群体也会像高转移群体一样导致细胞在组织中分散分布，尽管转移较少，但是仍需要重建发育树来区分此类情况(图4，A和B中间)。

为了定量研究转移表型和系统发育拓扑之间的关系，作者使用了Fitch-Hartigan最大简约算法。作者对该算法的实现提供了解释，给定树中每个细胞最终观察到的组织位置所需的最小数量的祖细胞进行转移转变。作者通过将推断的最小转移数除以可能的转移总数来定义了一个转移潜力的分数(称为“TreeMetRate”)，根据经验，作者观察到克隆群体的分布跨越了低转移和高转移TreeMetRate之间的全部转移表型(图4，B和C)。

作者进一步扩展了基于简约计算的方法，通过对包含给定细胞的所有子分类的TreeMetRate进行平均化，来量化单个细胞分辨率下的转移表型(称为“scMetRate”)。这种测量方法对亚克隆转移行为的差异很敏感(图4D)，并强调了克隆CP的双峰转移行为。此外，作者发现scMetRate与克隆群体大小、增殖特征或细胞周期阶段无关，表明它可以测量与增殖能力无关的转移潜能。总的来说，这些结果表明，该数据集中显示的癌细胞在克隆群之间和克隆群内表现出不同的转移表型，这可以通过谱系示踪有效地区分和量化，否则就会被传统方法所隐藏。

图4.直接从细胞谱系量化克隆群体的不同转移表型

5.转移表型差异的转录驱动子

作者接下来探索了单细胞转录状态能在多大程度上决定转移能力，通过比较成对的转录和谱系数据集，作者发现不同的转移行为对应于基因表达的不同，许多基因在转移中具有已知的作用。接下来，作者试图通过回归单细胞基因表达来全面识别与转移行为相关的基因，针对scMetRates（图5A），利用了单链核酸序列数据集和单细胞系统发育。许多已鉴定的阳性转移相关候选基因（即在高转移细胞中显著高表达的基因)在增强致癌性方面具有已知的作用(图5B)，如IFI27、REG4和TNNT1。相反的，许多阴性转移相关候选基因在降低癌细胞转移能力方面具有已知作用(图5B)，如NFKBIA、ID3和ASS1。其中的一个基因编码角蛋白17（KRT17），在低转移性肿瘤中的表达比在高转移性肿瘤中的表达要强烈得多。许多已鉴定的基因在每只小鼠中都得有显著复制(图5,C和D)。

虽然作者在回归分析中发现了许多有趣且可重复的候选基因，但尚不清楚它们是直接驱动转移表型还是仅仅与之相关，为了解决这一点，作者接下来探索了调节五个高表达候选基因(IFI6，IFI27，KRT17，ID3和ASS1)表达对转移行为的影响。首先，作者改造了A细胞，使其能够抑制或激活CRISPRi基因，然后使用每个基因的两个独立sgRNAs分别增加或减少五个基因靶标的表达；最后，作者使用transwell侵袭实验在体外测量了受干扰细胞的侵袭表型（图5,E和F）。正如假设的那样，CRISPRi基因的下调导致转移阳性相关基因的侵袭性降低，转移阴性相关基因的侵袭性增加(图5E)。相反，作者发现通过CRISPRa提高候选基因表达产生了完全相反的结果(图5F)，这表明侵袭表型可以通过测试的五个候选基因中的每一个的表达增加或减少来进行定量改变，特别是KRT17，这与谱系追踪实验的结果一致。

图5.不同的转移表型由基因表达的差异驱动

6.植入前细胞转移行为的异质性和遗传性

接下来，作者使用上面确定的阳性和阴性转移相关基因来定义一个新的转录信号(以下称为“转移信号”；图6A)。在植入到小鼠之前，细胞甚至就已经在转移特征上表现出明显的异质性(图6B)，并且像ID3和TNNT1这样的转移相关基因在植入前也有类似的异质性表达(图6C)。

虽然植入前细胞中预先存在的转录异质性值得注意，但尚不清楚这些差异是细胞的随机特性还是内在特性，是否可以在体外和体内稳定遗传。解决这个问题的方法是将同一克隆的两个细胞植入两只不同的小鼠体内，并观察它们的转移表型复制得如何，作者使用稳定标记克隆的细胞的内含子，鉴定了两个这样的例子，将来自于相同克隆群体的肿瘤细胞接种到两个不同的小鼠中(图6D)，值得注意的是，对于两对克隆种群中的每一对细胞，TreeMetRate几乎是相同的。事实上，在两个小鼠实验中，其中一对在所有克隆对中具有最相似的TreeMetRat（图6F）。综上所述，这些结果表明:①体内不同的转移表型是在植入前确定的(图6，B和C)；②转移表型可在几代之间复制，因此是可遗传的(图5，E和F)；③用于量化转移率的分析方法，包括系统发育的重建，在实验上是稳定可靠的(图6E)。

图6.转移表型是预定的、可遗传的和可复制的

7.转移表型的进化

尽管到目前为止作者已经讨论了转移表型是内在固有的和稳定遗传的，但在数据集中发现了一个明显的例外。具体而言，克隆#7(CP)表现出不同的亚克隆转移行为，其中一个分支频繁转移到其他组织，而另一个分支主要保留在右肺中(图6G)，这种区别反映在scMetRates的双峰分布中(图4D和图6H)。作者利用Hotspot算法探索了亚克隆结构与基因表达的关系，并确定了表现出可遗传表达程序的相关基因的两个模块。值得注意的是，模块1中基因的累积表达与低转移率相关，而模块2则相反(图6I)，同时，这两个模块广泛地对应于具有不同转移表型的两个分支(图6J)。在仅来自右肺的CP细胞的对照分析中也重现了该结果，这表明这些基因表达的差异确实反映了转移表型的差异，而不是组织特异性效应。这个例子表明，虽然转移率是稳定遗传的，但它也可以在克隆群体中进化。

8.转移的组织途径和拓扑结构

系统发育重建也使得描述关于转移的组织途径和转移方向性的详细历史成为可能。例如，CP的系统进化树揭示了从左肺到不同组织的五个不同的转移事件(图7，A和B)，其他系统发育揭示了更复杂的轨迹，如CP，其中早期原发性扩散到纵隔，随后可能在纵隔内转移，后来从纵隔扩散到肝脏和右肺(图7，C和D)。作者用组织转移概率矩阵(图7，E和F)总结了转移到每个组织和从每个组织转移的条件概率，值得注意的是，作者发现这些转移矩阵对于每个克隆都是不同的和独特的(图7G)。

接下来，作者使用主成分分析(PCA)通过克隆的转移矩阵对克隆行为进行分层(图7H)，并确定描述性特征，以捕捉每个克隆所经历的转移组织路径的差异(图7I)。这些描述性特征包括来自左肺的原发性播散(如CP，图7，A和B)，来自纵隔和纵隔内的转移(CP，图7G，左)，或肺叶之间的转移(CP，图7G，中间)，并且可以反映组织向性的内在差异。从这一特征分析中，作者还注意到许多克隆行为主要通过纵隔淋巴组织转移(图7，H和I)，这表明纵隔可能在这种小鼠模型中作为接种的连接，这可能是因为纵隔淋巴可以为组织连接提供有利的微环境。这一观察结果与该模型之前的实验一致，实验中，肿瘤进展过程中的大块活体成像显示，肿瘤似乎迅速定位于纵隔(图1C)，以及晚期疾病状态中，纵隔包含了大部分肿瘤负荷。这说明了谱系示踪剂是如何捕捉不同肿瘤群体中组织趋向性的细微差异的。

这些不同的转移结构可以显著影响癌症的进展、复发和治疗。例如，将转移细胞重新播散到原发肿瘤位点可以促进遗传多样性、治疗抗性和肿瘤转移潜能。在这个单独的数据集内，作者发现了所有这些拓扑的许多例子(图7K)；事实上，他们最常观察到的是每个克隆中所有拓扑结构的例子，以及更复杂的不服从简单分类的拓扑结构(例如，图7，右侧的D和G)，进一步强调了该异种移植模型中A细胞的侵袭性转移特性。延伸到这个模型之外，这些发现表明转移接种模式可能非常复杂或因患者而异。

图7.通过复杂的组织途径和多向拓扑结构接种转移瘤

结论

通过将基于Cas9的谱系示踪剂应用于小鼠肿瘤转移模型，作者观察到了仅通过亚克隆谱系信息才得以显现的转移生物学特征，包括不同肿瘤群体的广泛转移率、异质性转移表型的存在和稳定遗传性，以及癌细胞在该模型中扩散的复杂、多向组织途径。

作者观察到的肿瘤异质性可能会对理解癌症转移的生物学意义产生影响。首先，癌症转移不是简单的二元过程，而是存在多个不同的细胞状态，这些状态在转移潜能上具有特征性和分级差异，并且这些差异与增殖潜能正交。第二，在不同的转移状态下有特征性的转录差异，这些差异中涉及的多个基因足以单独调控细胞侵袭的程度，这表明连贯的转录程序驱动这些不同的转移状态。第三，虽然这些转录差异可以在体外检测到，但在这种情况下它们被抑制，在体内被放大，这表明组织环境和细胞表型之间存在某种相互作用。最后，这些表型在细胞世代中稳定遗传，并能够进化。了解这些表型差异的遗传和表观遗传基础——它们是如何产生、如何改变、如何影响细胞生物学——可以广泛地帮助我们理解癌症是如何传播和发展的。

文章来源：JeffreyJ.Quinnetal.Single-celllineagesrevealtherates,routes,anddriversofmetastasisincancerxenografts.Science,.

Doi:10./science.abc.

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