荧光探针半定量设计新策略助力癌症早期诊断
近日，中科院大连化学物理研究所韩克利研究员团队与朴海龙研究员团队合作，基于概念密度泛函理论中的局域亲电性指数，提出了一种高信噪比检测谷胱甘肽硫转移酶用荧光探针的半定量分子结构设计方法，相关成果以“Semi-QuantitativelyDesigningTwo-PhotonHigh-PerformanceFluorescentProbesforGlutathioneS-Transferases”为题发表在Research上（Research,,,DOI:10.//）。
研究背景
近年来，有机小分子荧光探针因其快速、实时、无损、灵敏度高及生物相容性好等优点而被广泛地应用于检测生物样品中包括酶在内的各种活性物种，它们通过将识别基团对目标物的识别信号转导为荧光团的荧光信号来达到检测的目的。谷胱甘肽硫转移酶（GST）作为II期解毒酶，能够催化谷胱甘肽（GSH）的巯基亲核进攻亲电性或疏水性物质以实现其生理功能。它的多种亚型同工酶在许多肿瘤细胞系尤其是抗癌药耐药性细胞系中过表达，因此，高信噪比检测GST对于癌症的早期诊断和治疗具有重要的意义。
先前报道的GST荧光探针多采用2,4-二硝基苯磺酰基（DNs）作为识别和反应基团，该基团虽能保证极高的灵敏度，但同时会带来严重的背景噪音。这是由该基团对GSH可观的非酶促化学反应活性导致的，这一点也体现在那些专门检测GSH等硫醇的诸多荧光探针上，因为它们同样采用该基团作为识别基团。为得到高性能的实用型GST荧光探针，需要降低识别基团的背景反应噪音。然而，灵敏度与背景噪音往往是相互制衡的一对因素，因此，对反应活性的微调是找准平衡点的关键。
研究进展
概念密度泛函理论（CDFT）从“分子的基态性质由其基态电子密度所唯一确定”这一定理出发，给出化学相关概念的确切物理定义及其表达式，可用于定量计算和衡量。基于上述理论及GST酶促反应的芳香亲核取代（SNAr）反应机理，中科院大连化学物理研究所韩克利研究员团队与朴海龙研究员团队合作，创造性地将CDFT中的局域亲电性指数ωk引入荧光探针的设计中，用于定量描述探针的背景反应活性，进而实现对反应活性有的放矢地微调。具体说来，如图1所示，以DNs为基准，通过改变取代基R的种类、数目及取代位置得到不同的识别基团，则兼具高灵敏度和低背景噪音的荧光探针候选分子必满足其ωk值小于且适度小于以DNs为识别基团的荧光探针（NI1）的相应值。
图1GST荧光探针的半定量分子结构设计
为验证该参数相关计算的有效性，研究人员首先计算了NI1阴离子自由基的电子自旋密度和原子自旋布居。如图2所示，计算结果复现了真实的区域选择性，即NI1与GSH的反应活性位点位于磺酰基所连接的碳原子上。
图2NI1阴离子自由基的电子自旋密度图及其识别基团部位的原子自旋布居（图中所标数据为乘以倍增因子后的数值）随后，非酶促反应动力学测试结果表明了参数ωk可以准确描述和预测探针分子与GSH的背景反应活性（图3（a））。酶促反应动力学测试结果则显示，ωk值的大小总体上还可以代表灵敏度的强弱（图3（b-d）），其中，偏离拟合线的探针反映了酶与底物之间存在的氢键作用、甲基化效应等“非化学”因素对催化效率的影响。此外，实验结果还表明，相对于酶促反应所对应的灵敏度kcat，非酶促反应所对应的背景噪音knonc对ωk值更敏感。（图3），这自洽地证明了通过微调ωk达到降噪且保持高灵敏度的目的存在着可操作空间。
图3(a)非酶促反应动力学常数knonc与ωk之间的构效关系；(b)GSTA酶促反应动力学常数kcat与ωk之间的构效关系；(c)GSTM酶促反应动力学常数kcat与ωk之间的构效关系；(d)GSTP酶促反应动力学常数kcat与ωk之间的构效关系经过理论计算预测与体外反应动力学光谱实验验证，ωk值略低于NI1（ωk=0.）的NI3（ωk=0.）被选中用于生物成像。如图4所示，无论是同一种GST阳性细胞（HepG2）经过不同预处理后的成像结果，还是不同种细胞（其中MHCC97L为GST阴性细胞，其余为阳性细胞）经过相同的NI3孵育后的成像结果，均显示出NI3对GST的高灵敏度、低背景噪音性响应。相比之下，辅助实验结果表明NI1对细胞中的GSH存在很强的背景噪音响应，而NI4（ωk=0.）和NI2（ωk=0.）则难以实现对细胞中GST的检测成像。
图4NI3用于细胞双光子荧光成像：(a)HepG2细胞用NI3孵育；(b)HepG2细胞经GST抑制剂EA预处理后再用NI3孵育；(c)HepG2细胞经GSH清除剂NEM预处理后再用NI3孵育；(d)A细胞用NI3孵育；(e)HeLa细胞用NI3孵育；(f)MHCC97L细胞用NI3孵育一个高性能的实用型荧光探针应当是识别基团与荧光团的优化组合。本研究中选择的萘酰亚胺（NI）为典型的双光子荧光团，其所固有的双光子吸收性能使得激发光可以选用长波长的近红外光，从而可以大幅度减弱生物组织中的自发背景荧光。此外，识别基团中具有强吸电子能力的硝基一方面在识别机制中贡献了亲电性，另一方面在信号转导机制中起到了诱导荧光团的激发态电子向其转移从而猝灭荧光的作用——萘酰亚胺系列探针的该供体型光致电子转移（d-PET）过程也为飞秒瞬态吸收光谱实验（图5a,b）和含时密度泛函理论（TD-DFT）计算（图5c）所首次捕获和证实。总之，高性能荧光探针NI3的整体低背景噪音既得益于其较低的非酶促反应活性，也离不开上述荧光猝灭机制的贡献。
图5NI系列探针荧光猝灭机理的实验与理论研究：(a)DMSO中NI系列探针的飞秒瞬态吸收光谱伪彩图；(b)不同波长位置处的动态追踪及相应的三指数函数拟合曲线（泵浦光为nm脉冲激光）；(c)B3LYP/aug-cc-pVDZ计算级别下对NI系列探针和NI电子跃迁的TD-DFT计算未来展望
理论上来说，本研究工作从概念密度泛函理论中引入的局域亲电性指数ωk并不局限于GST荧光探针的设计，而是可以扩展到任何基于软酸与软碱之间SNAr反应的荧光探针或药物分子设计。对于非酶促反应，ωk可以指示反应活性；对于酶促反应，ωk亦可以用于彰显化学因素之外的那些“非化学”因素所起的作用。更进一步地，联合CDFT中的局域亲核性指数Nk，则本研究工作对涉及亲核取代、亲电取代、亲核加成、亲电加成等反应的分子结构定量或半定量设计，都有一定的启示或借鉴意义。
作者简介
韩克利，中国科学院大连化学物理研究所首席研究员，博士生导师，大连化物所理论化学计算中心负责人，国家杰出青年基金获得者。主要的研究方向是复杂体系分子反应动力学理论与实验研究，涉及化学、物理、生物及材料等多领域的前沿和热点，并注重学科交叉，取得了系列原创性的研究成果，已在J.Am.Chem.Soc.，Angew.Chem.，Phys.Rev.Lett.，Nat.Commun.，Nat.Protoc.，Acc.Chem.Res.，Adv.Mater.等学术刊物上发表SCI学术论文余篇，他人引用超过余次。年“激光束与分子束反应动态学研究”获中国科学院自然科学奖一等奖，第一完成人；年获中国化学会青年化学家奖；年获大连市十大青年科技标兵；国务院政府特殊津贴；第四届辽宁省优秀科技工作者；年度中国科学院沈阳分院突出贡献青年科技专家；年获中国科学院青年科学家奖；大连市优秀科技专家；年辽宁省优秀科技专家；年“分子反应动力学的几个前沿问题研究：理论与实验”获辽宁省自然科学奖一等奖。，和年荣获ThomsonReuters和Clarivate全球高被引用科学家。
朴海龙，中国科学院大连化学物理研究所研究员，博士生导师，中国科学院分离分析重点实验室及大连化物所生物医学科学研究中心科研骨干，年毕业于韩国国立庆尚大学，获理学博士学位；毕业后于年-年，在UTMDAndersonCancerCenter做博士后研究。重点以细胞分子生物学、化学生物学、生物信息学及组学等多学科交叉为研究基础，开展基于代谢组学、化学蛋白质组学和非天然氨基酸技术方法的生物大小分子功能和分子机制研究。已在Nature，Nat.CellBiol.，NatureGenet.，CellRes.，CellMetab.，CancerLett.，Metab.-Clin.Exp.，Theranostics，Research等国际知名学术期刊上发表论文。
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《Research》是中国科协与美国科学促进会于年共同创办的定位为国际化、高影响力、世界一流水平、综合性、大型OA科技期刊，是美国《Science》自年创刊以来第一本合作期刊。主要发表生命科学、新材料研、新能源、人工智能、微纳米科学、环境科学、机械科学、机器人与先进制造8个具有巨大发展潜力的热点交叉领域突破性研究成果。目前已建立了93人的国内外各占50%、具有国际影响力的编委会，主编(中国)为西北工业大学常务副校长、中科院院士黄维，主编(国际)为美国明尼苏达大学麦克凯特杰出教授崔天宏。已被CAS、CSCD、DOAJ、ESCI、INSPEC、PMC、Scopus数据库收录。
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