文献解读构建单细胞癌症基因组时间序列模型

Survivalofthefittest：Itisnotthestrongestofthespeciesthatsurvive,buttheonemostresponsivetochange.——CharlesDarwin

研究背景

生物在进化过程中都会对环境或多或少产生应激，长此以往则会在群体进化中产生适应性，更适应环境的基因会更大限度被保留。并且，当环境发生变化时，这样的选择也会随之出现改变，甚至是天翻地覆的变化。

肿瘤细胞作为机体内适应性极强的细胞自然也不例外，因其十足的狡猾程度以及生长繁殖的快速，它对于机体变化体现的“适应性”更为明显。在肿瘤的诊疗过程中，有限的药物选择空间被癌细胞的快速进化所导致的耐药性极剧压缩，因此，我们的临床抗癌工程极易遭遇瓶颈。能够找到肿瘤细胞耐药性产生的原因，并且在其产生和发展过程中找到可以见缝插针的窗口期，就能让药物治疗方面的抗癌劣势有被扭转的可能。

纪念斯隆-凯特琳癌症中心（MKS）团队的计算机生物学家SohrabShah博士擅长于使用计算方法来了解癌症的进化和治疗反应，包括先进的机器学习和贝叶斯统计方法，以分析和解释癌症研究中的大型数据集，他表示：“一直以来，在癌细胞进化领域，科学家们都专注于从单一的数据中推断癌症的进化史，这种方法很容易出错。但通过时间序列数据，便可以得到更为清晰的癌症进化史。”

MKS团队与英属伦比亚大学的乳腺癌研究员SamuelAparicio领衔的研究团队在《自然》发表重要研究成果，他们通过长达3年的实验，获取了三阴性乳腺癌（TNBC）的单细胞时间序列全基因组测序（scWGS）数据。基于群体遗传学理论，他们发现可以利用拷贝数变化（CNA）代入Wright-Fisher模型预测癌细胞的进化。CNA指的是基因组上一些特定DNA片段的数量变化，尽管大量的证据都表明肿瘤基因组具有可塑性，但是CNA引起的基因组结构改变是否能驱动肿瘤的发生以及产生抗药性仍然是未解之谜，甚至有研究者质疑其在肿瘤发展过程中的重要性。

研究团队开发了一个实验和计算结合的平台，它由三部分构成：按照时间序列采样并对样本进行单细胞全基因组测序、单细胞基因组的系统发生学分类，以及一个基于群体遗传学用于预测细胞进化轨迹的模型。在研究过程中得到一个有趣的发现：中断化疗后，原先在自然状态下具有高适应性的TNBC细胞亚群会重新扩张，而获得抗药性的TNBC细胞亚群规模会变小，直至淘汰。而这就为上文所述的“窗口期”提供了实验依据。

研究结果

1.在一个永生化的-hTERT二倍体乳腺上皮细胞系中探究TP53缺陷带来的CNA和适应性改变

研究人员将3个时间序列的细胞样本进行比对，1个培育天的TP53野生（TP53WT）细胞系（个细胞基因组）和2个分别培育天和天的TP53(TP53-/-a和TP53-/-b)缺陷型细胞系（分别有和个细胞基因组），前者采样了4次，后者采样了7次。然后依据它们的CNA频谱构建了系统发生树，并计算各类节点的细胞数量。

发现野生型细胞系演化的3个主要亚群（F、E、D）的进化轨迹几乎一致，适应性系数没有太大差别，而缺陷型细胞系中均出现了非整倍体（CNA频率较高）亚群的扩张，并且这样的亚群适应性系数也是最高的。在最后的时间点上，原先的二倍体细胞几乎被淘汰。

在TP53突变型细胞系中随着时间推移二倍体细胞（K）逐渐减少，其中CNA频率最高的亚群A有着最大的正向选择系数。研究人员还发现，由TP53变异引起的CNA大都出现在一些乳腺癌常见的癌基因上（MDM4、MYC、TSHZ2），进一步的实验也验证了模型推导的结果，这表明TP53功能缺失会导致一些能增强细胞适应性的CNA。

2.研究来自四个PDX移植系列的TP53突变原发人类乳腺癌的时间序列CNA克隆扩增（将平台应用于人类乳腺癌的演化）

通过将人肿瘤细胞移植到小鼠上构建了人源肿瘤异种移植模型（PDX），形成一个更接近实际的癌症模型进行实验。包括1个HER2阳性（HER2+SA）和3个TNBC（TNBC-SA、TNBC-SA和TNBC-SA）PDX模型，分别在、、和天的时间内采样，生成了连续scWGS样本，，每个样本产生个高质量基因组的中位数。

我们发现，所有的PDX的生长速度都逐渐增加，并且都演化出了多个CNA水平不同的亚群。系统发育分析表明，所有PDX模型在CNA水平上均为多克隆，且从来自相同单细胞的单细胞RNA测序数据推断出是顺式基因表达效应。

与HER2+SA模型相反，TNBCPDX模型表现出克隆动态和选择系数变化的证据，与正选择和差异适应性一致。HER2+系列中的克隆表现出最大的阳性选择概率为0.67，表明总体克隆选择接近中性；相比之下，在所有三个TNBC系列中，至少一个克隆显示出大于0.9的阳性选择概率。3个TNBC的PDX均有亚群受到较强的正向选择（即亚群或随时间扩张或被淘汰，出现紫点则代表有正向选择），而HER2阳性的PDX中的亚群几乎接近于中性选择（所有亚群最终都占有一定比例）。

3.构建新样本下的PDX模型验证平台计算得出的适应性系数能否与实验结果吻合

团队验证了适应性系数作为正选择或负选择的指标。研究人员将TNBC-SAPDX的一个早期（X3）时间点采集的样本与一个晚期（X8）时间点采集的样本进行混合重新移植构建了新的PDX，使用从原始时间序列估计的选择系数从fitClone进行前向模拟，与之进行比较。然后利用计算平台得到的适应性系数对这两个PDX的进化轨迹进行预测，接着用实验验证。

最终证明了预测的最高适应性克隆(E)的扩增具有最高选择系数，即使从低初始比例开始也是如此。利用适应性系数预测的会出现扩张的亚群在小鼠体内最终占了最大的比例。这证明适应性系数对癌细胞的进化轨迹有着很好的预测性。

4.对带有TNBCPDX的小鼠进行原发性TNBC标准治疗（顺铂化疗）

在四个周期的治疗后再停药

在顺铂治疗以后，三种PDX均出现了抗药性，并且治疗前后癌细胞各亚群的适应性几乎倒转过来了。表明在施加了药物选择压力后，原先的低适应性亚群转而受到正向选择成为了高适应性亚群。

在停止顺铂化疗之后，原先在自然状态下具有高适应性的亚群会重新扩张，而获得抗药性的亚群规模变小

结论与意义

综上所述，结合遗传学计算公式，建立模型并依托于拷贝数改变（CAN）探测肿瘤细胞的适应性，以及研究肿瘤细胞基因组结构的变化，从而推测肿瘤的进化路线，是切实可行的。并且肿瘤的耐药性与治疗密切相关，结合对于肿瘤发生发展过程中的预测，为个体化治疗赢得时间并优化治疗方案有重要价值。

END

编辑：CaoF

审校：HuC

徐志远导师简介

外科学博士、主任医师、硕士生导师。主要研究方向为“胃癌肝转移机制与中西医结合治疗研究”。兼任中国抗癌协会腹膜癌专业委员会委员，中国抗癌协会胃癌专业委员会青年委员，中国医促会快速康复委员会胃肠学组委员，浙江省数理医学会胃癌专业委员会常委，浙江省医师协会外科医师委员会委员等。先后发表论文30余篇，其中在SCI收录杂志发表20篇，参与编写著作1部，获省中医药科学技术一等奖1项。目前主持及参与国家自然科学基金、浙江省科技厅重点研发、省自然基金、省中医药重点项目。

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