最新癌症治疗中的CART的开发策略
尽管目前可以使用具有良好制造规范（GMP）级的CAR-T产品，但仍需要改进CAR-T的制造工艺以增加临床使用率[16]。更有效，更经济地获得T细胞分离，激活，扩增和基因修饰的方法值得探索[17,18]。CAR-T疗法在癌症治疗中的成功使它陷入了障碍。
最近，已经开发并报告了更有效的解决方案。因此，在这篇综述中，我们讨论并总结了CAR-T治疗方面的近期显着改进和突破，以应对现有挑战（图1）。
2.CAR-T治疗的增强的持久性和抗肿瘤特性
2.1CAR-T结构的优化
2.1.1细胞外结构域的优化
设计用来鉴定肿瘤抗原的单链可变片段（scFv）是CAR-T细胞外区段的主要组成部分。抗原异质性是阻碍CAR-T在癌症治疗中发挥作用的重要因素。据报道，不同的抗原表达密度和同时存在的不同抗原对于肿瘤逃逸或复发是至关重要的[11]。因此，促进CAR-T特异性抗原识别可能有助于增强CAR-T在癌症治疗中的功效。
细胞外结构域的优化
在实体瘤中有一部分具有干样特性的细胞被称为癌干细胞（CSCs），因为它们与肿瘤异质性进化和对常规抗肿瘤疗法的抗性有关[19]。鉴于此，已经选择了越来越多的CSC相关抗原来增强CAR-T功能。
分化簇（CD）是多种侵袭性实体瘤中CSC的常见标志物，Vora等人构造了靶向CAR-T的CD（CART），并证实了其在患者源性胶质母细胞瘤（GBM）异种移植模型中的优越功效，进一步表明CART的治疗剂量不会在人源化CD34+鼠标模型[20]的正常CD+造血干细胞和祖细胞中诱导毒性。此外，主要的组织相容性复合物I类链相关基因A/B（MICA/B）和UL16结合蛋白（ULBP）。细胞（GSCs）和表达CAR-T的自然杀伤组2成员D（NKG2D）已显示出对GBM模型具有有效的肿瘤清除作用，且与治疗相关的毒性微乎其微[21]。
同时靶向多种抗原靶向两种或更多种肿瘤抗原是重要的策略。首先研究了针对单个肿瘤抗原的不同CAR-T细胞的顺序给药，并在临床研究中显示出良好的效果[22]。在89例难治性/复发性（r/r）B细胞恶性肿瘤患者（51例急性淋巴细胞白血病患者和38例非霍奇金淋巴瘤患者）中进行的一项初步研究（ChiCTR，编号ChiCTR-OPN-）显示-CD19和抗CD22CAR-T细胞（CAR19/22T细胞混合物）表现出显着的抗肿瘤作用（中位无进展生存期分别为13.6个月和9.9个月）和安全性（高度CRS和神经毒性）：分别为22.4％和1.12％的患者）。此外，只有一名患者在随访期间经历了抗原丢失的复发，这表明CAR-T鸡尾酒疗法可以有效地减少由肿瘤抗原逃逸引起的复发[23]。在20名患有r/rB急性淋巴细胞白血病（B-ALL）的儿童中观察到了类似的结果。事实证明，CAR19/22T细胞鸡尾酒疗法是有效且安全的，并且从长期来看，它可以改善缓解的持久性（ChiCTR，编号ChiCTR-OIB-）[24]。
在相同的T细胞上构建多目标CAR也是一种有效的方法。Dannenfelser等在33种肿瘤类型和34种正常组织中筛选了超过万种双重抗原和大约万种三重抗原，并预测2-和3-抗原和或非逻辑门中的组合抗原将优于目前的临床选择，以改善CAR中的肿瘤辨别力-T疗法[25]。
连续进行了针对2靶和3靶CAR-T的相应临床前研究，并获得了令人满意的结果。Ruella等设计了具有CD19和CD双重表达的CAR-T，并进一步证实了与单表达或合并的CAR-T组合相比，它在B-ALL模型中具有更高的活性[26]。
此外，设计了针对两种不同抗原的新型表达CAR-T的抗体模拟受体（amR），以避免线性组装的单链和每个scFv的大尺寸引起的蛋白质折叠受损的潜在限制。例如，双特异性表皮生长因子受体（EGFR）-人表皮生长因子受体2（HER2）amR-T在小鼠模型中显示出显着的抗肿瘤功效[27]。抗CD19/20/22CAR-T是三重目标修饰的一个例子。
Fousek等通过三顺反子转基因在单个T细胞上建立了这种CAR结构，发现除了CD19+B-ALL模型外，它还可以有效地杀死CD19CAR-T疗法或CD19基因敲除的原发性B-ALL模型后复发患者的CD19-blasts无论是体内还是体外[28]。
2.1.2细胞内结构域的优化改善细胞内激活域从仅包含CD3ζ信号域的第一代（1G）CAR到结合一个或多个共刺激域的2G和3GCAR，CAR结构得到了不断的改善。如今，已设计出具有更完善的监管能力的4G和5GCAR结构，以解决持久性问题并增强CAR-T的效力[29]。
由六个肽（CD3γε-CD3δε-CD3ζζ）组成的CD3是T细胞表面广泛分布的白细胞分化抗原。αβT细胞受体（TCR）-CD3复合物是众所周知的T细胞抗原识别和信号转导的关键决定因素[30]。CD3多样性被认为是CAR-T功效的重要调节剂。其中，包含三个基于免疫受体酪氨酸的激活基序（ITAM）的CD3ζ细胞质域已被广泛用作固定模块，以在CAR-T构建中传递主要的激活信号[31]。
最近，Feucht等人证明CD3ζITAM数目和位置都对CAR-T功能有显着影响。他们构建了不同的单个含ITAM的CAR-T突变体，分别称为1XX，X2X和XX3，并证实了1XXCAR-T细胞具有平衡的记忆和效应子属性。目前正在进行使用1XXCAR-T细胞的相应临床试验[32]。此外，CD3ε，δ和γ链也可能是CAR设计的有效选择。Wu等首先证实将CD3ε掺入CAR结构可以增强CAR-T细胞的抗肿瘤活性。尽管CD3ε的单磷酸化ITAM可以通过募集抑制性C端Src激酶（Csk）激酶来减少CAR-T的细胞因子产生，但CD3ε的基本残基富集序列（BRS）可以通过p85增强CAR-T的持久性（磷酸肌醇3-激酶的调节亚基）募集[33]。
改善细胞内共刺激域
CAR-T功效的另一个重要的细胞内决定因素是共刺激结构域。发现单个共刺激域的简单修饰能够增加CAR-T的持久性和功能。据报道，基于CD28的间皮素CAR-T中的单个氨基酸残基的改变（将天冬酰胺变为苯丙氨酸）可促进胰腺癌异种移植模型中CAR-T的持久抗肿瘤控制，并减少T细胞分化和衰竭[34]。
另一个例子是Li等人设计的基于可回收的4-1BB（也称为肿瘤坏死因子受体超家族9，TNFRSF9）的CAR-T。他们首先证实，通过在细胞内结构域中将赖氨酸突变为精氨酸来阻断CAR泛素化可以将内在的CAR重定向回T细胞表面，从而提高CAR-T治疗的持久性和抗肿瘤功效[35]。
但是，不同的共刺激域组合可能是一种有利的策略。编码CD28的CAR突触募集淋巴细胞细胞特异性蛋白酪氨酸激酶（LCK），以诱导抗原非依赖性的CAR-CD3ζ磷酸化并增强抗原依赖性的CAR-T激活，而4-1BB编码的CAR突触募集胸腺细胞表达的分子。参与选择包含磷酸酶1（SHP1）磷酸酶复合物以减少CAR-CD3ζ磷酸化的（THEMIS）-Src同源结构域。基于这些事实，经证实可募集LCK来增强4-1BBCAR-T的抗肿瘤动力学的CAR突触或SHP1来下调CD28CAR-T的细胞因子释放的CAR突触有助于增强CAR-T的功能[36]。类似地，还发现将诱导型共刺激物（ICOS）[37]或其配体（ICOSL）[38]与4-1BB结合可以增强CAR-T的功效。
2.1.3.T细胞选择的优化
考虑到CAR-T细胞的异质性，选择T细胞表型和亚型也是确保CAR-T功能的关键因素。最近，单细胞RNA测序（scRNA-seq）已用于获得CAR-T细胞的转录谱[39]。邓等通过scRNA-seq检测了24例大B细胞淋巴瘤（LBCL）患者的自体CD19CAR-T产物的转录组学特征，发现达到完全缓解（CR）的患者的记忆表达CD8T细胞比具有部分反应（PR）或进行性疾病（PD）的患者要多三倍[40]。
据报道，NOTCH及其下游靶标的叉头盒M1（FOXM1）负责将正常的CAR-T细胞转化为具有优异抗肿瘤功效的干细胞记忆样CAR-T细胞（CAR-iT）[41]。
关于T细胞亚型，用CAR工程改造的天然杀伤性T（NKT）细胞和γδT（γδT）细胞已显示出显着的抗肿瘤潜力。Vα24不变自然杀伤性T细胞（iNKT）是T细胞的独特子集，它表达经典的不变TCR-α链（Vα24-Jα18）和具有有限Vβ片段（Vβ11）的TCR-β链，可识别CD1d呈递的脂质抗原并诱导先天性和适应性免疫反应[42]。
Heczey等构建了靶向CAR2的神经节苷脂GD2NKT，该CAR-iNKT靶向于神经母细胞瘤细胞上高表达的抗原，并在转移性神经母细胞瘤小鼠模型中证实了其强大的抗肿瘤活性。与T细胞不同，这些CAR.GD2NKT细胞不会触发移植物抗宿主病（GvHD）[43]。
γδT是另一个具有先天性和适应性免疫特性的T细胞亚群[44]，它可以以抗原依赖性/非依赖性的方式充当专业的抗原呈递细胞（APC）或裂解肿瘤细胞，以增强肿瘤控制并避免肿瘤发生。靶向肿瘤外毒性。例如，已发现CARVδ2T能够将加工过的肽呈递给应答者αβT（αβT）细胞以增强肿瘤控制[45]，并且已证实抗GD2CARVγ9Vδ2T可避免等同表达GD2但不参与Vγ9Vδ2TCR的非肿瘤细胞的非特异性杀伤[46]。此外，如Rozenbaum等人所述，CARγδT也可能有助于解决抗原丢失问题。发现与普通的CD19CAR-T细胞不同，CD19CARγδT还可以靶向CD19阴性白血病细胞以实现完全的肿瘤控制，尤其是在唑来膦酸盐引发后[47]。
2.2.CAR-T的联合治疗策略为了应对CAR-T治疗后的高肿瘤复发率以及CAR-T在实体瘤中的有限疗效，已开发出联合疗法以弥补CAR-T细胞的固有缺陷并协助CAR-T发挥更好的抗肿瘤作用影响。报道了许多有希望的结果。
2.2.1.增强抗原识别的组合策略将CAR-T与表观遗传调制器相结合为了解决由肿瘤抗原表达的下调或丧失引起的肿瘤逃逸，在CAR-T治疗中已经广泛研究了常规表观遗传调节剂对抗原密度和分布的调节作用。Anurathapan等首先证实了CAR-T疗法中表观遗传调节剂的抗原敏化作用。他们发现，地西他滨的应用（一种低甲基化剂，可以通过使DNA去甲基化来增加肿瘤抗原的表达）可以上调抗性CAPAN1胰腺癌细胞中的粘蛋白1（MUC1）表达，而先前的MUC1CAR-T治疗诱导的抗原表达较低，从而使其易受感染进行CAR-T治疗[12]。Driouk等证明丙戊酸是一种有效的组蛋白脱乙酰基酶（HDAC）抑制剂，能够上调急性髓样白血病（AML）细胞中NKG2DL的表达，从而增强NKG2DCAR-T细胞的抗肿瘤功效[48]。也有报道说，多发性骨髓瘤（MM）细胞表面的B细胞成熟抗原（BCMA）裂解和随后由多亚基γ-分泌酶复合物（GS）引起的可溶性BCMA（sBCMA）释放是降低CAR-T疗效的重要机制。结果，在MM临床前模型中，发现小分子GS抑制剂（GSI）可同时增加BCMA和降低sBCMA水平，并提高CAR-T疗效[49]。正在进行一项临床试验，研究将GSI应用于BCMACAR-T治疗的可行性和安全性（NCT）。
将CAR-T与双特异性抗体结合
双特异性T细胞衔接子（BiTE）是一类由两种scFv组成的双特异性抗体，一种通过识别T细胞表面蛋白CD3ε募集CAR-T和旁观者T细胞，另一种靶向肿瘤细胞表面的第二种抗原。BiTE的功能使其能够物理连接肿瘤和T细胞，从而介导T细胞对不同肿瘤细胞的杀伤[65]。EGFRvIII特异的CAR-T细胞无法消除异质性胶质母细胞瘤，但会导致EGFRvIII-/EGFR+胶质母细胞瘤细胞增殖[66]。鉴于此，Choi等人。开发了CART.BiTE（一种分泌EGFRvIII的EGFRvIII特异性CAR-T），并证实了其在胶质母细胞瘤小鼠模型中根除异质肿瘤细胞的能力[50]。
将通用CAR-T产品与双特异性适配器的顺序或同时交付相结合是另一种策略。每个双特异性衔接子由针对各个抗原的标签（例如，荧光素，异硫氰酸酯和生物素）缀合的抗体片段组成，其可以被相应的抗标签CAR-T细胞结合。基于此，Lohmueller等人设计了一种抗生物素CAR-T，并确认了被生物素化双特异性抗体（抗CD19和CD20）包被的肿瘤细胞诱导的激活，该肿瘤细胞进一步以剂量依赖的方式介导了肿瘤细胞的裂解和干扰素（IFN）-γ的产生[51]。同样，也有报道称，荧光素连接的双特异性衔接子混合物能够将抗荧光的CAR-T细胞与肿瘤细胞桥接，并能有效根除异质实体瘤[52]。
2.2.2.克服抑制性TME的组合策略将CAR-T与化学疗法相结合将CAR-T与化学疗法相结合的主要目的是通过重塑肿瘤的免疫微环境来实现更好的肿瘤浸润和消退。例如，已发现将CAR-T与白介素（IL）-12加上阿霉素结合可在异种移植实体瘤模型中增加注入的T细胞的深层穿透力并增强CAR-T的功能。
考虑到化学治疗剂可以刺激肿瘤细胞产生吸引T细胞的趋化因子的假设，Hu等人测试了不同的药物，发现阿霉素可以促进TME渗透CXCL9/CXCL10（由肿瘤细胞产生）介导的T细胞渗透，并且IL-12诱导高干扰素（IFN）-γ表达协同诱导趋化因子的产生[53]。
从临床角度来看，在CAR-T输注之前预先使用化学治疗药物也是一个不错的选择。例如，在抗EGFRCAR-T（NCT）的扩大且平行的临床试验中，纳布-紫杉醇和环磷酰胺的预用药在增强CAR-T功效方面表现出优异的性能。该组合被证实是最佳的基质耗竭方案，可以通过结合分泌的酸性和富含半胱氨酸的蛋白（SPARC）来耗竭肿瘤基质，从而促进CAR-T的浸润[54]。
将CAR-T与局部疗法相结合局部治疗通常用作重塑TME的典型方法。将不同的局部疗法与CAR-T细胞结合起来也显示出了极大的可行性。例如，据报道，在先进的同基因原位GBM模型中，GD2CAR-T静脉内给药后局部放疗的后续应用对于获得完整的治疗反应是必要的。活体显微镜成像进一步表明放疗是CAR-T细胞有效脉管外渗及其在TME中扩增的重要促进剂，从而导致更强大和持久的抗肿瘤反应[55]。考虑到轻度热疗对TME的重塑作用（例如，减少致密的基质结构和间质液压力以及增加血液灌注和免疫细胞募集），同时进行CAR-T和光热疗法的应用也显示出优异的CAR-T积累和在实体瘤模型中的肿瘤控制功效[56]。
将CAR-T与Checkpoint封锁相结合如前所述，高表达的免疫和代谢检查点是抑制性TME的主要成分。在癌症治疗中，已经使用了不同的检查点封锁来维持CAR-T功能。关于免疫检查点，CAR-T和免疫检查点封锁的组合在临床前（例如，与PD-1和PD-L1组合）和临床（例如，与pembrolizumab和pembrolizumab联合使用）均表现出显着的抗肿瘤作用durvalumab）方面[57]。对于异常的代谢微环境，相应的封锁也有可能使CAR-T疗效最大化[58]。腺苷是在TME中高水平产生的一种免疫抑制代谢产物，可通过与免疫细胞上表达的腺苷2a受体（A2aR）结合而抑制免疫反应。据报道，将CAR-T与A2aR特异性小分子拮抗剂SCH-结合使用有助于克服TME介导的耐药性并增强CAR-T功能[67]。
同样，Yazdanifar等。证明将CAR-T与抗性因子抑制剂（例如吲哚胺2,3-二加氧酶-1（IDO1），环加氧酶1/2（COX1/2）和半乳糖凝集素9（Gal-9）结合使用也可显着增强CAR-T在难治性胰管腺癌治疗中的疗效[68]。
2.2.3.将CAR-T与疫苗结合以促进体内扩增肿瘤疫苗，包括全细胞和分子疫苗，也是提高CAR-T效力的重要助推器。全细胞疫苗可分为肿瘤细胞或树突状细胞（DC）来源。一个例子是表达巨细胞病毒（CMV）-pp65蛋白，免疫刺激分子CD40L和OX40L（CD）以及诱导型安全开关胱天蛋白酶9（iC9）的K衍生全细胞疫苗。Caruana等证实了这种疫苗在异种移植肿瘤模型中具有增强CAR重定向的CMV特异性细胞毒性T细胞（CTL）的抗肿瘤功效的能力[59]。
对于DC疫苗，Wu等设计了具有EGFR途径底物8衍生肽的DC脉冲的Eps8-DC疫苗，发现Eps8-DC可以有效地促进CAR-T细胞的体外扩增，同时增加中央记忆T细胞的比例并降低效应记忆T细胞比例，并在复发性白血病模型中增强CAR-T功能[60]。另外，分子疫苗在促进CAR-T扩增中起重要作用。分子疫苗应用中的主要挑战是有效递送至次级淋巴器官。
Irvine等人考虑到“白蛋白搭便车”现象（分子一端的脂质尾巴可与血清白蛋白结合，使分子进入白蛋白后进入淋巴结），Irvine等人合成了一种由与亲脂性白蛋白结合尾巴相连的货物（抗原或佐剂）组成的安非他明疫苗（AMP），它可以顺利进入淋巴结并诱导T细胞启动增加30倍，具有更好的肿瘤控制效果和较低的全身毒性[69]。随后，开发了AMP-CD19疫苗。在多种实体瘤小鼠模型中，发现它能够诱导注入的CAR-T细胞数量增加倍，并增强抗肿瘤功效[61]。
2.2.4.将CAR-T与溶瘤病毒结合起来应对实体肿瘤挑战溶瘤病毒（OVs）被认为是癌症免疫疗法的有希望的合作伙伴，因为它们会影响癌症免疫周期中的许多关键步骤。OVs可以通过直接裂解肿瘤细胞来增强抗肿瘤免疫反应，从而导致免疫激活成分（如可溶性抗原和癌蛋白）的释放。另外，这些OV也可以被修饰以表达不同的治疗基因，从而进一步增加先天和适应性免疫细胞的积累和功能[70]。尽管CAR-T疗法在实体瘤中遇到了多种挑战，但溶瘤病毒，特别是修饰的溶瘤病毒，表现出了显着的协同作用和增强作用[71]。
首先，抗原递送可以从根本上解决抗原异质性的问题。一个典型的例子是编码截短的CD19t蛋白（OV19t）的溶瘤牛痘病毒。被这些OV感染的肿瘤细胞在表面上产生从头CD19，这使得能够特异性和有效地靶向CD19CAR-T细胞。反过来，CAR-T介导的肿瘤溶解导致OV19t的释放，并进一步促进CD19t在肿瘤细胞中的表达[62]。用细胞因子武装OVs是另一种选择。
众所周知，许多细胞因子（例如，IL-2，IL-15和肿瘤坏死因子[TNF]-α）与免疫细胞的激活和功能高度相关。即使在胰腺导管腺癌（PDA）的免疫抑制性TME中，CAR-T与表达溶瘤腺病毒（OAd）的TNF-α和IL-2（OAd-TNFα-IL2）的结合也表现出显着的抗肿瘤作用，因为OAd-TNFα-IL2不仅增加了CAR-T和宿主T细胞的肿瘤浸润，而且以巨噬细胞的M1极化和DC成熟增加重塑了TME[63]。
此外，用免疫检查点阻断剂改造的溶瘤病毒在实体瘤中也表现出与CAR-T的显着协同作用[72]。例如，Tanoue等。用一种表达PD-L1阻断迷你抗体的辅助依赖型广告构建了OAd，并进一步证实了其在HER2前列腺癌异种移植模型中显着增强HER2特异性CAR-T功能的能力[64]。作为CAR-T治疗的有希望的合作伙伴，OVs提供的特殊“递送系统”为解决CAR-T细胞在实体瘤中面临的挑战提供了新的视角。
3.增强CAR-T疗法的临床安全性和可及性3.1.CAR-T疗法的安全维护不良反应（AEs）是有效应用CAR-T治疗的主要障碍。在临床试验中通常可以看到威胁生命的毒性以及随之而来的死亡或患者放弃治疗[73]。就像Penack等人所说的那样。据回顾，CAR-T的独特毒性特征，包括CRS，ICANS，心脏毒性，肺毒性，代谢并发症，继发性巨噬细胞激活综合征（sHLH/MAS）和血细胞减少症，也是临床试验中经常发生的事件使用CD19CAR-T治疗[74]。此外，癌症患者对CAR-T毒性的个性化反应使其成为更严重的问题[75]。
CRS是CAR-T最常见的副作用，具有特征性的临床症状，从轻度（例如流感样发烧，疲劳和头痛）到严重（例如危及生命的多器官系统衰竭）。此外，肿瘤抗原结合CAR-T产生的炎症细胞因子（例如TNF-α，IFN-γ）与随后激活的旁观者免疫细胞（例如巨噬细胞和内皮细胞）之间的正反馈回路释放了促炎细胞因子（例如IL-1和IL-6）被认为是CRS发生的主要机制[76]。ICANS是CAR-T疗法和CRS或随后的疗法中第二常见的副作用，它具有广泛的临床表现，例如语言/行为障碍，周围神经病变和急性脑水肿[77]。尽管尚未完全了解ICANS的发病机理，但高浓度促炎性细胞因子诱导的内皮细胞活化以及CAR-T和细胞因子向中枢神经系统的扩散后血脑屏障（BBB）破坏被认为是关键因素[78]。为了解决这些问题，已经采取了许多管理策略，例如准确的分级和干预，以最大程度地降低CAR-T的毒性[79]。目前，已经开发出越来越多的可以直接预防或阻断CAR-T毒性的安全开关，以帮助避免在临床癌症患者中避免AE而不削弱CAR-T疗效，并且在临床前和临床上均观察到了显着结果[80]。
3.1.1.内生开关抑制性CAR（iCAR）由靶向正常组织特异性抗原的scFv和免疫抑制受体的强大的急性抑制性信号传导域组成，是一种有前途的内源性方法，可以限制CAR-T治疗中不需要的AE。Fedorov等构造了基于PD-1和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）的iCAR-T，并证实了其对T细胞活性的选择性和可逆性抑制，这提供了动态安全开关，可防止潜在的靶标脱靶肿瘤作用[81]。
另一个例子是基于杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR）/PD-1的iCAR（iKPCAR）。与iKPCAR整合的抗CD19CAR-T不仅对恶性B细胞表现出明显的细胞毒性，而且在体外和伯基特淋巴瘤异种移植模型中都避免了对CD19阳性健康B细胞的损害[82]。
合成Notch（SynNotch）系统是另一种典型的内源安全开关。当SynNotch部分被肿瘤细胞上的一种抗原激活时，识别第二种肿瘤抗原的CAR结构便开始转录[83]，从而可以通过以下方式特异性激活这些双受体AND门CAR-T细胞：双抗原肿瘤细胞[84]。在小鼠模型中，针对由ROR1特异性CAR-T引起的致命性骨髓衰竭（包含ROR1+基质细胞），Srivastava等人设计了具有EpCAM或B7-H3（在ROR1+肿瘤细胞上表达的抗原，而不在ROR1+基质细胞上表达的抗原）特异性synNotch受体的CAR-T，以提高选择性，从而既可以安全地靶向与正常细胞充分分离的肿瘤细胞，又可以预防肿瘤的发生。潜在的靶上非肿瘤效应[85]。
3.1.2.外生开关小分子药物是外源性安全开关的最常见选择，因为它们可以通过调节蛋白质与蛋白质之间的相互作用来调节细胞功能。安全开关可根据其功能分为开和关两种类型，为确保CAR-T安全，已同时使用了这两种类型。关于开关，据报道，基于脂环蛋白的开关是CAR-T的合适选择，因为人视黄醇结合蛋白4（hRBP4，脂环蛋白家族的成员）在存在下列条件下与工程化的hRBP4结合剂相互作用。小分子A，因此成功调节了CAR-T细胞的活性[86]。
关于断开开关，Giordano-Attianese等人通过将化学可破坏的异二聚体（CDH）掺入合成异二聚体CAR中来开发STOP-CAR-T。CDH具有高亲和力的蛋白质界面，并可以被小分子药物破坏，从而可以在定时给药下使CAR-T动态失活[87]。另一个例子是用利妥昔单抗响应开关设计的Fms相关酪氨酸激酶3（FLT3）特异性CAR-T，可有效保证AML缓解后骨髓的恢复[88]。
自杀基因也是安全开关的流行选择。诱导型胱天蛋白酶9（iCasp9）是众所周知的自杀基因，已被掺入CAR-T细胞中以消除不适当活化的CAR-T细胞。Gargett等。证明了AP（一种小分子二聚体药物）在触发由iCasp9高度表达的CAR-T细胞快速凋亡中的应用[89]。另一个自杀基因是单纯疱疹病毒1型胸苷激酶（HSV1-tk）基因。已经发现在前药更昔洛韦（GCV）的给予下能够诱导转导的CAR-T细胞的自杀。Murty等人将CAR-T与突变版本的HSV1-tk基因（sr39tk）整合在一起。他建立了一种B7H3特异性sr39tkCAR-T，并通过生物发光和正电子发射断层扫描（PET）成像在腹膜内给予GCV后证实了其在骨肉瘤模型中的完全消融[90]。
除了这些不可逆的全或无开关之外，还已经设计了越来越多的可调开关来获得对CAR-T活性的更灵活和准确的调制。Richman等人通过将CAR融合到配体诱导的降解（LID）域中。发明了一种新颖的CAR-LID结构，并证实了在CAR-T治疗的肿瘤模型中存在小分子配体的情况下，它有能力根据需要下调CAR表达。这是由于小分子配体诱导的LID内的神秘地胶暴露，这可以进一步导致CAR-LID蛋白的降解和CAR在T细胞上的表达损失[91]。
肽特异性可转换CAR-T（sCAR-T）是另一个有前途的选择。由肿瘤抗原特异性Fab和肽新表位组成的双功能开关可以仅与sCAR-T结合并以剂量依赖的方式调节其活性。B细胞白血病异种移植模型中CD19特异性sCAR-T的动态活性调节是一个成功的例子[92]。酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼的剂量可滴定给药也可以实现CAR-T功能的动态调节。它可以通过抑制CD3ζ的磷酸化和T细胞受体相关的蛋白激酶70kDa（ZAP70）的ζ链，诱导CAR结构中的功能关闭状态，并在停药后完全恢复。在用CAR-T处理的CRS小鼠模型中证实了保护作用[93]。
基于安全开关的不断更新设计，已经建立了许多使CAR-T治疗更可靠的平台，例如亲和力控制的CAR平台（将可诱导和可控制的功能集成到CAR结构中）[94]，人性化的人工受体平台（通过双特异性靶向分子操纵CAR-T）[95]和不同的通用CAR平台[96,97,98]。
3.2.CAR-T治疗的可及性增加3.2.1.T细胞的获取当前，自体T细胞是CAR-T细胞的主要来源。然而，高成本和复杂的获取过程以及来自免疫抑制或免疫缺陷癌症患者的T细胞可用性有限，限制了自体CAR-T疗法的广泛临床应用[99]。解决方案之一是开发具有高效率和低成本的技术来分离T细胞。例如，据报道DNA适体是实现高纯度T细胞分离的有效工具。
Kacherovsky等已经证实，DNA适体可以以低成本和高产率帮助分离纯净和无痕的CD8-T细胞。从这些细胞衍生的CAR-T细胞在B细胞淋巴瘤小鼠模型中的增殖，表型和功效方面与抗体分离的CAR-T细胞相当[]。探索同种异体通用CAR-T细胞是另一种可能的策略[]。
目前，来自健康供体的外周血单核细胞（PBMC），脐带血（UCB）和诱导性多能干细胞（iPSC）是主要的异体来源[]。其中，源自iPSC的现成CAR-T产品FT已成为有前途的选择[]。它是由FateTherapeutics设计的新型CD19CAR-T，它编码具有单个基于免疫受体酪氨酸的活化基序（1XX）的CAR，以平衡CAR-T的效应子和记忆程序[32]。将其插入T细胞受体α恒定（TRAC）位点以延迟CAR-T的分化和衰竭[]，并通过TRAC的双等位基因破坏编辑了TCR表达消除，以减轻GvHD的风险[]。根据2年ASH年会上的一份报告，在临床前模型中，FTCAR-T与主要的CD19CAR-T相比，具有更好的抗肿瘤功效和存活率，为随后的首个I期临床试验提供了支持[]。
3.2.2.CAR-T制造工艺的优化目前，病毒载体介导的半随机DNA整合是在T细胞上表达CAR结构的主要方法[]。然而，病毒载体的制造过程复杂且昂贵，繁琐的生产，病毒载体转染的CAR-T的质量控制步骤以及对意料不到的副作用的长期监控也限制了其广泛的临床应用。有鉴于此，具有低成本和高安全性的非病毒传递系统已成为更好的选择[]。
PiggyBac（PB）和SleepingBeauty（SB）转座子系统，CRISPR系统（聚簇的规则间隔的短回文重复序列）介导的定点整合以及mRNA载体都是流行的非病毒方法，已证实在CAR-T转染中有效；每种产品的最新改进进一步优化了它们在CAR-T制造中的功效。对于PB，Bishop等人。报道说，dbDNA是缺少不良质粒特征的最小DNA载体，可能是PB介导的CAR-T产生的可行替代方法，具有较低的临床应用风险和成本[]。同时，Querques等基于过度活跃的SBX变体的晶体结构构建了高溶解度的SB转座酶（hsSB），以克服不受控制的转座酶活性，并进一步证实hsSB可以在不存在转染试剂的情况下产生具有优异抗肿瘤功效的CAR-T细胞[]。
具有内源基因破坏的CRISPR-Cas9介导的CAR-T构建是另一个优化。例如，将CD整合到PD1基因座的CD19CAR-T不仅在临床前模型中显示出显着的抗肿瘤功效，而且在r/r侵袭性B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）患者中也显示出安全性和有效性。研究者发起的临床试验（IIT）[]。此外，与基于Cas9的方法相比，AAV-Cpf1系统（将腺相关病毒与CRISPR-Cpf1结合）据报道在CAR-T细胞中产生双敲除更有效。
一个例子是CD22特异的AAV-Cpf1KIKOCAR-T，一种具有同源性指导的修复敲除和免疫检查点敲除的CAR-T产品，其表现出较低的精疲力竭指标，但与Cas9CAR-T相比具有可比的肿瘤控制作用[]。靶向的mRNA纳米载体由于其简单性而具有吸收性。通过将它们与淋巴细胞简单混合，这些mRNA纳米载体可以有效介导CAR-T细胞的基因组编辑，在此期间，也可以实现TCR的破坏或中央记忆表型的转化[]。
4.结论与展望
CAR-T疗法作为肿瘤免疫疗法中的一种有前途的选择，已展现出显着的潜力和临床应用前景。从CAR-T的修改和生产到CAR-T的组合，最新的突破无疑消除了阻碍CAR-T的乌云，并燃起了希望之光。如果这些突破可以得到后续大型临床研究的支持，那么CAR-T可能会为癌症治疗带来新的蓝图。值得相信的是，随着CAR-T探索的不断深入和广泛，这种疗法最终将在很大程度上使临床癌症患者受益。
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