STM基于结构导向设计的高活性高选

酶美

WDR5属于WD40域重复家族（WD40-repeat）蛋白，其通常作为脚手架蛋白（Scaffoldprotein）参与多种致癌蛋白的相互作用。WDR5拥有两个重要的蛋白相互作用位点：一是WIN位点(WDR5interactionsite)，通过识别WIN序列，WDR5与MLL1,RBBP5,ASH2L以及DYP-30形成核心功能性催化复合物，催化染色质组蛋白H3K4的甲基化，从而诱导其下游基因的异常表达；二是WBM(WDR5bindingmotif),可以结合除MLL1复合物以外的蛋白(c-MYC等)，诱导肿瘤的发生。研究表明，在MLL基因重排的急性骨髓性白血病（MLL-rAML）中，去除WDR5-MLL1复合物可以有效抑制和阻断白血病的发生。此外，WDR5还参与其它多种肿瘤于疾病发生，比如乳腺癌，胰腺导管腺癌（PDAC），神经细胞瘤，Burkitt淋巴瘤等。因此，发展小分子抑制剂来阻断WDR5-MLL1或者WDR5-cMYC蛋白-蛋白相互作用，是有效抑制和治疗癌症与相关疾病的重要策略。目前，已有多种关于阻断WDR5与MLL1及WDR5与c-MYC蛋白-蛋白相互作用的小分子抑制剂被报道，这些小分子抑制剂能够在体外实验中很好地结合WDR5，但抑制癌细胞生长的能力较弱，目前尚未有临床前期癌症动物模型中具有很好活性的WDR5小分子抑制剂被报道。这些小分子抑制剂活性低可归因于：1）基于ReceptorOccupancy药理学的小分子抑制剂不能持续有效地阻断蛋白-蛋白相互作用；2）WDR5有WIN和WBM等结合位点，可以与多种蛋白结合，而小分子抑制剂只能靶向一个位点，从而只能部分抑制其致癌性能。因此，发展新型阻断WDR5致癌生物学功能的策略具有重要的科学研究价值和临床意义。

蛋白质水解靶向嵌合体（PROTACs）是一项很有应用前景的靶向蛋白降解的方法。PROTAC是一个双功能小分子，能将E3泛素连接酶招募到靶蛋白（Proteinofinterest）附近，形成三元复合物，诱导靶蛋白泛素化，从而经过蛋白酶体Proteasome进行降解。与传统小分子相比，PROTACs可以去除整个蛋白，从而有效阻断靶蛋白的催化和非催化功能，在催化特性，高选择性，克服耐药性以及靶向不可成药性靶点方面表现出更显著的优势。

年9月29日，美国西奈山伊坎医学院的JianJin课题组和北卡罗来纳大学教堂山分校的GangGregWang课题组在ScienceTranslationalMedicine发表了题为AselectiveWDR5degraderinhibitsacutemyeloidleukemiainpatient-derivedmousemodels的研究性论文（JianJin教授和GangGregWang教授为共同通讯作者，余旭芬博士、李东旭博士和JitheshKottur博士为共同第一作者）。该论文研究结果显示，利用PROTAC技术并结合结构导向设计（Structure-baseddesign）发现的WDR5降解剂MS67，能够高效、选择性地降解WDR5，并在体外实验中有效地抑制MLL-rAML以及胰腺导管腺癌（PDAC）细胞系的生长，且在血液瘤（AML）异种移植动物模型和患者源性异种移植血液瘤模型（PDX）中也能显著地抑制肿瘤生长，而其母体小分子抑制剂OICR-则不具有肿瘤抗增殖活性，表明WDR5降解剂MS67可能为治疗急性骨髓性白血病提供一种潜在的极具吸引力的治疗策略。

首先，作者选定小分子抑制剂OICR-作为WDR5的配体，通过不同性质与长度的链，连接VHL-1和Pomalidomide两种类型E3连接酶配体。经过初步生物活性评估，作者发现MS33在MV4;11细胞中能够较好地降解WDR5。深入分析发现MS33只能以中等活性降解MLL-rAML细胞系中WDR5的表达水平，且在高浓度区域出现“钩子效应”（hookeffect），并且MS33在胰腺导管腺癌（PDAC）细胞系中没有降解能力。

为了进一步优化设计WDR5降解剂，作者解析出具有高分辨率的三元复合物WDR5-MS33-VCB的单晶结构(1.7?)，经过结构分析，作者认为进一步缩短MS33连接链的长度可以拉近WDR5和VHL之间的距离，增加WDR5蛋白和VHL蛋白之间，WDR5与VHL配体以及VHL与WDR5配体之间的相互作用；另一方面，同时提高WDR5和VHL配体的结合亲和力可以进一步增加三元复合物的稳定性。通过观察WDR5-MS33-VCB的晶体结构，作者发现在MS33分子结构哌啶环引入两个甲基可以进一步占据WDR5的疏水区，增强WDR5与配体间的疏水作用；上端苯环引入F原子取代基也可以增强其与WDR5蛋白残基Phe和Tyr的相互作用；文献报道VHL-1-Me比VHL-1具有更高的结合VHL蛋白的能力。因此，基于这些结构信息，作者设计和筛选出更高活性的WDR5降解剂MS67，同时也成功地解析出WDR5-MS67-VCB的单晶结构(2.1?)。通过等温滴定量热（ITC）实验，进一步证明较之MS33(Kd=nM;α=1.66)，MS67更能有效地形成稳定的三元复合物(Kd=52nM,α=2.74)。

相比较MS33，MS67不仅可以更高效率地降解MLL-rAML细胞系中的WDR5(MV4;11,DC50=3.7nM，效率大约是MS33的70倍)，也能有效地降低PDAC细胞系中的WDR5蛋白水平。机制实验证明了MS33和MS67这两种降解剂诱导WDR5的降解是与VHL依赖性泛素蛋白酶系统有关，并且washout实验证明此降解过程是可逆的。基于质谱的蛋白质组学研究表明，MS67具有极高的选择性，在鉴定的多个蛋白中，仅有WDR5被降解；另外作者还考察了MS67对22个甲基转移酶，45种激酶和44种GPCR,Transporters以及离子通道等，MS67仅显示出对Sigma2有微摩尔级别的抑制活性。同时，作者通过分析晶体结构和残基变异实验进一步确认出对MS67降解活性影响颇大的蛋白残基Asp和Tyr。

综合分析MIAPaCa-2和MV4;11两组细胞系的RNA-seq实验，结果表明MS67诱导降解WDR5与基因敲低WDR5引起的基因表达变化（DEGs）是一致的。MS67不仅能够降解WDR5，还会引起其相互作用蛋白从染色质上解离，比如MLL-C,RBBP5,Menin和c-MYC等组分，同时还能有效抑制H3K4的甲基化水平，以及抑制WDR5靶基因（如RPS10,RPL11和CSNK1E等）的表达，而小分子抑制剂OICR-和MS67阴性对照化合物MS67N对此则无显著影响，从而体现出降解剂MS67的明显优势。

接下来，作者评估了MS67对AML和PDAC细胞系抗增殖能力，发现MS67对MLL-rAML细胞系很敏感，低纳摩尔浓度就能高效地抑制细胞增殖；相反，对于不包含MLL-r的细胞系则没有明显抑制作用；而且MS67对于难以攻克的PDAC细胞系也有很好的细胞增殖抑制活性，并能有效阻断其细胞周期和诱导细胞凋亡。母体小分子OICR-和阴性对照MS67N则没有活性。在此基础上，他们测试了MS67的体内药代动力学(PK)，通过小鼠腹腔给药，MS67可以实现持续的体内高浓度暴露，且在12小时之后的暴露浓度（0.5nM）还远高于MV4;11的GI50(15nM)。以此为基准，作者开展了血液瘤（AML）异种移植和患者源性异种移植血液瘤（PDX）两种动物模型实验来探索MS67体内实验效果。在这两种模型中，MS67都能够很好地抑制肿瘤的生长，延长小鼠生存率；同时，小鼠对于MS67的耐受性良好，无体重减轻等副作用发生。值得一提的是在药效动力学（PD）实验中，小分子OICR-在血清和肿瘤样品的浓度要远远高于MS67的浓度，但OICR-对动物模型中的肿瘤生长没有抑制作用，进一步证实MS67作为WDR5降解剂的抗肿瘤生长能力优于其母体小分子抑制剂OICR-。

综上所述，该研究小组利用PROTAC技术和晶体结构导向设计，发现了新型高效高选择性的WDR5降解剂MS67。MS67可以有效地降解WDR5蛋白水平，从而调控WDR5靶基因表达，抑制细胞增殖达到抗肿瘤效果，这为后续开发治疗MLL-r急性白血病提供新策略奠定了基础。

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